Une étude ultrastructurale confirme la formation de cellules syncytiales simples et hétérotypiques dans les fluides bronchoalvéolaires du COVID

Virology Journal volume 20, Article number: 97 (2023) Citer cet article

399 accès

3 Altmétrique

Détails des métriques

Il a été rapporté que le SRAS-CoV-2 induisait des fusions cellulaires pour former des syncytia multinucléaires qui pourraient faciliter la réplication virale, la dissémination, l'évasion immunitaire et les réponses inflammatoires. Dans cette étude, nous avons rapporté les types de cellules impliquées dans la formation de syncytia à différents stades de la maladie COVID-19 par microscopie électronique.

Liquides bronchoalvéolaires légers (n = 8, SpO2 > 95 %, pas d'hypoxie, dans les 2 à 8 jours suivant l'infection), modérés (n = 8, SpO2 90 % à ≤ 93 % à l'air ambiant, fréquence respiratoire ≥ 24/min, essoufflement, dans les 9 à 16 jours suivant l'infection) et sévères (n = 8, SpO2 < 90 %, fréquence respiratoire > 30/min, apport externe d'oxygène, après 17 jours d'infection) Les patients COVID-19 ont été examinés par PAP (identification du type de cellule), immunofluorescence (pour le niveau d'infection virale), balayage (SEM) et microscopie électronique à transmission (TEM) pour identifier les syncytia.

Des études d'immunofluorescence (anticorps spécifiques de la protéine S) de chaque syncytium indiquent un niveau d'infection très élevé. Nous n'avons trouvé aucune cellule syncytiale chez les patients légèrement infectés. Cependant, une fusion initiale de la membrane plasmique identique (neutrophiles ou pneumocytes de type 2) et hétérotypique (neutrophiles-monocytes) (indiquant l'initiation de la fusion) a été observée sous TEM chez des patients modérément infectés. Des cellules syncytiales de grande taille (20 à 100 μm) entièrement matures ont été trouvées chez des patients atteints du syndrome de détresse respiratoire aiguë sévère (de type SDRA) d'origine neutrophile, monocytes et macrophages sous SEM.

Cette étude ultrastructurale sur les cellules syncytiales de patients COVID-19 met en lumière les stades de la maladie et les types de cellules impliquées dans les formations de syncytia. La formation de syncytia a d'abord été induite dans les pneumocytes de type II par fusion homotypique, puis avec des cellules hématopoïétiques (monocytes et neutrophiles) par fusion hétérotypique au stade modéré (9 à 16 jours) de la maladie. Des syncytia matures ont été signalés dans la phase tardive de la maladie et formaient de grandes cellules géantes de 20 à 100 μm.

Les syncytia sont des cellules multinucléées exceptionnellement grandes générées par la fusion de deux ou plusieurs types de cellules similaires/différents sous des influenceurs externes/internes tels que des molécules/une infection virale [1]. La membrane plasmique de deux cellules ou plus fusionne pour former une seule bicouche lipidique, entraînant la fusion du cytoplasme mais pas du noyau [2, 3]. Naturellement, la formation de syncytia a été médiée par des protéines fusogènes et a été rapportée dans les fibres musculaires, les barrières placentaires et les ostéoclastes osseux [3,4,5]. Cependant, mécaniquement, il a été induit par la fusion cellulaire médiée par le virus, où la membrane des virus enveloppés fusionne avec les membranes plasmiques des cellules. Plusieurs coronavirus du rhume courants, tels que hCoV-HKU1, hCoV-NL63 et hCoV-229E ont été signalés pour former des syncytia dans des modèles de culture cellulaire, mais il n'y a aucun rapport sur la formation de syncytia in vivo [6, 7].

La formation de syncytia est également observée dans les cultures cellulaires et les tissus infectés par le SARS-CoV-1, le MERS-CoV ou le SARS-CoV-2 [8,9,10,11,12,13,14,15]. Des syncytia induites par le SRAS-CoV-2 ont été signalées dans les échantillons d'autopsie de tissu pulmonaire chez des patients COVID-19 gravement infectés [1, 12, 14, 16, 17, 18, 19, 20]. Le SRAS-CoV-2 a induit la formation de syncytia in vitro [21,22,23,24] ainsi qu'in vivo [12, 16, 20, 22], avec la fusion de pneumocytes et de lymphocytes dans les poumons [12, 20].

La génération et le type de cellules impliquées dans la fusion des cellules syncytiales aux différents stades de la maladie COVID-19 ont été peu rapportés. Ce rapport aborde ces lacunes pour renforcer la compréhension de la formation des cellules syncytiales chez les patients COVID-19 en utilisant des approches basées sur la microscopie au niveau de l'ultrastructure en utilisant l'imagerie PAP (Papanicolaou), IF (Immunofluorescence), SEM (Microscopie Electronique à Balayage) et TEM (Microscopie Electronique à Transmission). Nous avons signalé la présence de cellules syncytiales d'origine unique et multiple dans le BALF (fluides de lavage bronchoalvéolaire) de patients de type SDRA (syndrome de détresse respiratoire aiguë) induits par COVID-19.

Le fixateur de Karnovsky (0,5 % de glutaraldéhyde + 2,0 % de paraformaldéhyde), l'hématoxyline, l'éosine, l'orange G., l'eau de Scott, le xylène, le DPX, le PBS, la poly-L-lysine, le kit d'enrobage époxy et le DAPI ont été achetés auprès de la société chimique Sigma, MO, États-Unis. BSA, l'éthanol provenait de Himedia et le Triton X-100 provenait de Fisher Scientific. Le tétroxyde d'osmium a été obtenu auprès de Ted Pella, États-Unis, l'acétate d'uranyle auprès de TAAB, Royaume-Uni, et le citrate de plomb auprès de Ladd. L'anticorps primaire polyclonal spécifique anti-SARS-CoV-2 (n° de catalogue ab275759) et l'anticorps secondaire anti-lapin conjugué Alexa fluor-594 (n° de catalogue ab150080) ont été achetés auprès d'Abcam, Plc, Royaume-Uni.

Des échantillons BALF ont été prélevés sur des patients positifs au SRAS-CoV-2 intubés dans les services COVID-19, AIIMS, New Delhi. Tous les échantillons ont été prélevés entre le 3 octobre 2020 et le 31 janvier 2021 (fichier supplémentaire 1 : tableau supplémentaire 1). Les patients ont été classés en trois groupes selon les directives du Conseil indien de la recherche médicale (ICMR) [25]. Ces groupes étaient (A) des patients atteints d'une infection légère non SDRA (non SDRA, n = 8 ; SpO2 > 95 %, pas d'apport d'oxygène, uniquement des symptômes des voies respiratoires supérieures avec une légère fièvre et sans essoufflement ni hypoxie, 2 à 8 jours après les premiers symptômes), (B) une infection modérée (n = 8, fréquence respiratoire ≥ 24/min, essoufflement et niveau de SpO2 de 90 % à ≤ 93 % à l'air ambiant, apport externe d'oxygène, 9-16 jours après les premiers symptômes), et (C) patients de type SDRA sévère (type SDRA, n = 8 ; fréquence respiratoire > 30/min, essoufflement, niveau de SpO2 < 90 % à l'air ambiant, et admis à l'HDU/USI avec assistance externe en oxygène, à partir du 17e jour) [26, 27]. Il y avait une très grande variabilité dans la réponse du patient à l'infection et au niveau de la maladie COVID-19 par rapport aux jours suivant l'infection. Le nombre maximum de patients a été enregistré avec des symptômes bénins de type maladie dans les 2 à 8 jours, des symptômes modérés de type maladie dans les 8 à 16 jours et des symptômes graves de type maladie > 17 jours après l'infection [26, 27]. Ainsi, nous avons collecté les échantillons uniquement auprès des patients qui remplissaient les conditions de la maladie (directive ICMR) et les critères de délais pour cette étude [25]. Un test RT-PCR a été réalisé pour confirmer l'infection au COVID-19 pour tous les patients recrutés dans l'étude (enregistrés mais non inclus).

L'échantillon BALF (15-20 ml) a été principalement fixé dans 20 ml fraîchement préparés, solution de Karnovsky 2X (1 % final de glutaraldéhyde + 4,0 % de formaldéhyde) dans un tampon phosphate 0,2 M et stocké à 4 °C dans un réfrigérateur désigné COVID-19. Un médecin de garde a examiné et contre-vérifié tous les dossiers médicaux des patients. La démographie des patients, les symptômes et les signes, les résultats de la RT-PCR, les résultats radiographiques, le traitement, les soins de soutien et les données de survie ont été enregistrés mais non inclus (fichier supplémentaire 1 : tableau supplémentaire 1).

Après la fixation primaire, la solution BALF a été diluée dix fois avec une solution de NaCl 0, 1 M et filtrée à travers un tamis cellulaire en maille de nylon avec un pore de 100 μm. Le filtrat a été centrifugé à 2500 tr/min pendant 3 min dans un seau oscillant, et l'excès de mucus a été éliminé en lavant les culots cellulaires (2 à 3 fois pendant 10 min) avec une solution de PBS. Le contenu cellulaire a été enrichi par centrifugation à 1200 g pendant 5 min et remis en suspension dans le fixateur primaire A (0,5 % glutaraldéhyde 2,0 % paraformaldéhyde dans du tampon 0,1 M PB). Ces échantillons ont été traités pour la coloration PAP, IF, SEM et TEM.

Pour la coloration PAP, les cytofrottis ont été préparés en utilisant 200 µl de BALF à 800 tr/min pendant 5 min sur des lames de verre revêtues de poly L-lysine et conservés dans de l'éthanol à 90 %. Les frottis ont été lavés à l'eau pendant 1 min et la coloration à l'hématoxyline a été effectuée pendant 2 à 4 min avec un lavage d'une minute sous l'eau courante du robinet, l'eau de Scott et à nouveau l'eau du robinet, respectivement. Les frottis ont été progressivement déshydratés dans de l'éthanol à 70 %, 95 % et 100 % pendant 2 min chacun, traités avec de l'Orange G pendant 4 min et progressivement déshydratés. Les frottis ont été plongés dans une coloration à l'éosine pendant 10 min et traités avec de l'éthanol à 95 % et de l'acétone pendant 2 min chacun. Enfin, les frottis colorés ont été traités avec du xylène (3 fois, 5 min chacun) et montés en DPX.

Pour l'étude d'immunofluorescence, les échantillons BALF ont été lavés avec un tampon phosphate 0, 1 M (3 fois) et des frottis ont été préparés avec 10 µl d'échantillon sur des lames de verre recouvertes de poly-L-lysine et séchés à l'air à température ambiante. Les frottis ont été perméabilisés par du PBST (0,1 % de Triton X-100 dans une solution saline de tampon phosphate 1X, PBS) et incubés avec une solution de blocage (2 % de BSA dans du PBS) pendant 30 min. Après blocage, il a été incubé avec l'anticorps primaire (Abcam ab275759, anticorps polyclonal contre la protéine de pointe S1, dilution 1:500) pendant quatre heures dans une chambre humide à température ambiante. Après lavage avec du PBS, un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore (anticorps secondaire anti-lapin conjugué Alexa fluor-594, Abcam, Cat No.- 150 080; dilution 1: 500;) a été ajouté et incubé pendant une heure à température ambiante dans la chambre noire. Les frottis ont été lavés avec du tampon phosphate et du DAPI (1 µg/mL) a été ajouté et incubé pendant 5 min. L'excès de DAPI a été éliminé par lavage avec du PBS et les frottis ont été montés avec du glycérol à 90 %. L'imagerie de fluorescence a été réalisée sur un microscope confocal à balayage laser (Leica SP8, Allemagne).

Pour SEM, les composants cellulaires fixes enrichis et primaires de BALF ont été déshydratés avec de l'éthanol et séchés au point critique (E-3100, Quorum Tech). Les échantillons ont été montés sur du ruban adhésif double face sur les talons en aluminium et ont été enduits par pulvérisation cathodique avec un revêtement par pulvérisation cathodique à base d'or (HHV BT-150) pendant 180 s. Des micrographies électroniques ont été obtenues sur un SEM EVO18 (Zeiss, Allemagne) fonctionnant à une tension d'accélération de 20 kV, une distance de travail moyenne de 8 à 10 mm avec un détecteur d'électrons secondaires (SE) et des grossissements allant de 5 000X à 30 000X.

Pour l'imagerie TEM, les constituants cellulaires enrichis de BALF ont été principalement fixés avec 2,5 % de glutaraldéhyde + 2,0 % de paraformaldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M (PB). Les culots cellulaires ont été lavés avec du PB 0,1 M (pH 7,4) et post-fixés avec du tétroxyde d'osmium à 1 % dans du PB 0,1 M (pH 7,4) pendant une heure (fixation secondaire) à 4 °C. Les pastilles ont été lavées avec de l'eau distillée pendant 2 h et colorées avec une coloration en bloc avec de l'acétate d'uranyle à 2 % dans de l'éthanol à 50 %. Ces échantillons ont de nouveau été lavés avec de l'eau distillée et déshydratés avec une série d'éthanol (50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %). Les pastilles déshydratées ont été infiltrées avec du toluène/résine et incorporées dans de la résine Araldite CY212. Les blocs ont été polymérisés à 65°C pendant 48 h. Des coupes ultrafines (~ 70 nm) ont été préparées à l'aide d'un ultramicrotome UC7 (Leica) et montées sur des grilles. Les coupes ont été colorées avec 5 % d'acétate d'uranyle et 5 % de citrate de plomb et imagées à l'aide du microscope électronique à transmission Talos F200 (Thermo Fisher Scientific).

Des échantillons BALF enrichis en cellules de patients légers, modérés et sévères de type SDRA (n = 8 chacun) ont été fixés avec la solution de Karnovsky et imagés pour PAP (cytofrottis), IF (anticorps spécifique de la protéine S pour le niveau d'infection), SEM (ultrastructure de surface) et imagerie TEM (informations ultrastructurales). Nous n'avons trouvé aucun syncytia chez les patients légèrement infectés (Fichier supplémentaire 1. Figure S1). Cependant, des cellules syncytiales d'origine cellulaire unique et différente avec une morphologie et une forme distinctes ont été observées chez des patients de type SDRA modéré et sévère. Nous avons constaté que la plupart des pneumocytes de type II, des neutrophiles, des monocytes et des macrophages fusionnaient pour former les cellules syncytiales du BALF. La forme varie d'arrondie à ovale et les tailles de 20 à 100 μm.

Nous avons identifié des cellules syncytiales multinucléées générées par des pneumocytes de type II chez des patients modérément infectés. L'imagerie PAP a montré des changements cellulaires réactifs avec une hypertrophie nucléaire et une condensation cytoplasmique dans les syncytia d'origine pneumocyte de type II. Le cytoplasme des cellules multinucléées, denses et vacuolaires confirme les cellules syncytiales d'origine pneumocytes de type II. Ces cellules ont montré une immunofluorescence modérée avec un anticorps spécifique à la protéine de pointe du SRAS-CoV-2, indiquant la présence du virus. L'imagerie SEM a révélé une morphologie de surface avec de petites microvillosités, caractéristique des cellules pneumocytes de type II (Fig. 1). Nous n'avons pas pu trouver de telles syncytia sous TEM qui auraient pu révéler une meilleure compréhension des changements ultrastructuraux après la formation de syncytia.

Cellules syncytiales générées à partir de la fusion homotypique de pneumocytes de type II de patients COVID-19 au stade modéré de la maladie (entre 9 et 16 jours après les premiers symptômes). (A) Le cytoplasme des cellules multinucléées denses nucléées et vacuolaires confirme les pneumocytes de type II sous imagerie PAP. (B) La fusion membranaire complète des pneumocytes de type II (deux) avec une immunofluorescence modérée à l'aide d'un anticorps primaire spécifique à la protéine de pointe SARS-CoV-2 indique la présence du virus. (C) L'image SEM (ultrastructure de surface) des pneumocytes de type II a montré une petite structure semblable à des microvillosités, caractéristiques des pneumocytes de type II. N, noyau ; flèche blanche, virus SARS-CoV-2 ; flèche orange, microvillosités.

Nous avons également observé les cellules syncytiales d'origine neutrophile sous PAP, IF, SEM et TEM dans un état pathologique modéré. L'imagerie PAP a identifié la formation syncytiale de deux neutrophiles à noyaux multiples (noyaux non multilobés) (Fig. 2A). Les études d'immunofluorescence confirment l'infection cellulaire sévère et la présence du virus SARS-CoV-2. Les cellules multinucléées avec des signatures de neutrophiles typiques confirment leur origine (Fig. 2B). L'imagerie SEM a révélé une cellule syncytiale d'environ 40 μm avec la caractéristique (surface rugueuse avec saillie de la membrane) d'origine neutrophile (Fig. 2C). L'imagerie TEM a montré l'initiation de la fusion de la membrane plasmique avec deux neutrophiles adjacents (Fig. 2D). Ces points d'initiation de fusions membranaires étaient clairement visibles à un grossissement plus élevé, ce qui peut être une étape initiale essentielle pour la formation de cellules syncytiales après l'infection virale (Fig. 2E-F). De multiples particules virales immatures et matures ont été observées dans le cytoplasme de ces cellules (flèches).

Les cellules syncytiales d'origine neutrophile ont montré l'initiation de la fusion de la membrane plasmique. (A) Imagerie PAP de syncytia avec le noyau dense et le cytoplasme granuleux confirmant l'origine des neutrophiles. (B) Cellule syncytiale d'origine neutrophile avec plusieurs noyaux et immunofluorescence confirmant l'infection par le SRAS-CoV-2 Image C. SEM d'une cellule syncytiale d'origine neutrophile de taille 40 μm. La surface rugueuse avec des protubérances de la membrane plasmique avec beaucoup de particules virales (flèche blanche) a confirmé l'origine des neutrophiles. (D, E & F) images TEM à faible et fort grossissement montrant l'initiation de la formation de syncytia (fusion membranaire). N, noyau ; M, mitochondries ; P, phagosomes ; RB, corps résiduel ; B, bactéries ; Pse, pseudopodes ; flèche blanche, virus SARS-CoV-2 ; pointe de flèche noire, le site de la fusion de la membrane.

Aux stades modérés de la maladie, plusieurs syncytia hétérotypiques issus de la fusion neutrophiles-monocytes ont été observés. Ces cellules ont été observées en imagerie PAP, IF et TEM. L'imagerie IF confirme la formation de cellules syncytiales avec des neutrophiles et des monocytes avec une infection SARS-CoV-2 modérée à sévère (Fig. 3B-C). TEM a révélé l'initiation de la fusion de la membrane plasmique avec des cellules adjacentes (pointes de flèches noires) à plusieurs endroits. Les cellules d'origine monocytaire (cellules moyennes) présentaient des caractéristiques ultrastructurales caractéristiques telles qu'un noyau bilobé, la présence d'un corps lipidique et des granules phagocytaires (Fig. 3D-G). Les caractéristiques de l'ultrastructure comprennent de nombreux granules spécifiques primaires azurophiles (grands et denses aux électrons) (petits, légers), des pseudopodes dans la membrane plasmique, une membrane cellulaire hautement pliée et un grand nombre de phagocytes des cellules adjacentes aux monocytes les confirmant comme granulocytes neutrophiles. Ces cellules présentaient un nombre relativement plus élevé de virus matures dans le cytoplasme (flèche blanche).

Cellules syncytiales formées par de multiples origines de cellules de patients atteints de SDRA induit par COVID-19. (A) Imagerie PAP d'origine monocyte et neutrophile avec noyau multilobé et en forme de fer à cheval. (B) Les noyaux multilobés et la nucléine centrique confirment les cellules neutrophiles et monocytes, respectivement, avec un niveau modéré d'infection par le SRAS-CoV-2 en IF. (CF) Fusion membranaire entre les monocytes et deux neutrophiles adjacents sous imagerie TEM avec différents grossissements. Le monocyte a été identifié en raison de la présence de corps lipidiques actifs et d'un noyau central. Les granules neutrophiles et les phagocytes confirment l'origine neutrophile des cellules adjacentes. N, noyau ; M, mitochondries ; RB, corps résiduel ; L, corps lipidique ; flèche blanche, virus SARS-CoV-2 ; pointe de flèche noire, site de fusion de la membrane plasmique.

Les cellules syncytiales matures n'ont pas été observées dans le BALF des patients légèrement et modérément infectés. Cependant, sous imagerie SEM, des cellules syncytiales de grande taille (jusqu'à 100 μm) avec une morphologie ovale ont été observées chez les patients sévères de type SDRA. La morphologie de surface ultrastructurale indique une origine neutrophile (Fig. 4A), monocytaire (Fig. 4B) et macrophage (Fig. 4C). La présence de pseudopodes dans la membrane plasmique et la membrane cellulaire hautement repliée confirme l'origine neutrophile (Fig. 4A). D'autres cellules syncytiales matures d'origine monocytaire ont été identifiées par leur surface lisse et la présence de nombreuses structures de type bactérienne, révélatrices de cellules phagocytaires (Fig. 4B). La morphologie de surface telle que les projections cytoplasmiques et la structure ondulée ressemblent au macrophage (Fig. 4C). Ce type de syncytia mûri n'a pas été observé sous TEM.

Cellules syncytiales matures sous imagerie SEM. Les cellules syncytiales ont été générées par la fusion de plusieurs cellules d'origine (A) neutrophile (confirmée par projection de surface), (B) monocytes (identifiés par surface lisse) et (C) origine macrophage (projection cytoplasmique). Patients COVID-19 de type SDRA Des cellules syncytiales matures ont été observées chez des patients de type SDRA sévère, mais pas au stade léger ou modéré de la maladie. Flèche blanche, virus SARS-CoV-2 ; B, bactéries (flèche orange).

La maladie COVID-19, causée par l'infection par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), est devenue une menace majeure pour la santé publique mondiale [28, 29]. Chez de nombreux patients, les symptômes restent légers (uniquement des infections des voies respiratoires supérieures avec une légère fièvre et sans essoufflement ni hypoxie, SpO2 > 95 %) et disparaissent automatiquement en quatre à sept jours par une médication basée sur les symptômes. Certains patients qui ont développé des affections primaires de type SDRA doivent être hospitalisés avec une gravité modérée (fréquence respiratoire ≥ 24/min, essoufflement et niveau de SpO2 de 90 % à ≤ 93 % à l'air ambiant). Un nombre maximum de patients ont présenté des symptômes modérés de type maladie entre 8 et 15 jours après les premiers symptômes. Cependant, 2 à 5 % des patients COVID-19 ont développé des affections graves de type SDRA avec des problèmes respiratoires fréquents, une SpO2 faible (< 90 %) et des scores CT élevés (> 16) [30, 31]. Un nombre plus élevé de patients a été signalé après le 17e jour de la maladie. La formation de syncytia est associée à la gravité du COVID-19. Cependant, il est possible que la formation de syncytia soit également liée à la durée de l'infection, ainsi qu'à d'autres facteurs tels que la réponse immunitaire et la charge virale du patient. On ne comprend toujours pas entièrement comment la formation de syncytia contribue à la pathogenèse du COVID-19. Ainsi, nous avons pris les deux paramètres comme la gravité de la maladie et le jour du prélèvement de l'échantillon après l'infection pour égaliser les conditions des patients.

L'imagerie histologique des échantillons d'autopsie pulmonaire (décès dû au COVID-19) a montré des cellules syncytiales géantes multinucléées [12, 15, 16, 20]. Cependant, il est difficile d'explorer l'initiation de la formation de syncytia et sa corrélation avec le stade de la maladie à partir de ces échantillons d'autopsie. En effet, les techniques histologiques basées sur la microscopie optique sont inadaptées à l'identification des cellules respiratoires et hématopoïétiques impliquées dans la formation des syncytia. Notre étude ultrastructurale basée sur la microscopie électronique d'échantillons BALF de patients COVID-19 légèrement infectés n'a pas trouvé de syncytia (fichier supplémentaire 1. Figure S1). Cela indique que les virus SARS-CoV-2 pourraient ne pas initier la fusion membranaire au stade initial de la maladie. Cela peut être dû au fait que le virus a tendance à se multiplier, à tropisme et à infecter le maximum de cellules pour se propager, y compris l'épithélium buccal et respiratoire, dans la phase initiale de la maladie [32, 33]. À ce stade, le virus n'a pas besoin de facilitation particulière pour sa réplication, sa dissémination, son évasion immunitaire et ses réponses inflammatoires car la réponse immunologique de l'hôte n'a pas encore été activée de manière efficace. Cependant, au stade modéré de la maladie, une pression négative a été créée sur la réplication et la dissémination du virus SARS-CoV-2 en activant les réponses immunologiques humorales et cellulaires [34]. L'activation des macrophages et l'infiltration de granulocytes dans le tissu pulmonaire (neutropénie) obligent le virus à activer son mécanisme de sauvegarde pour faciliter sa réplication et sa dissémination par la fusion de la membrane plasmique des cellules respiratoires et hématopoïétiques [20, 35, 36]. Cela pourrait être une cause de fusion de la membrane plasmique avec des cellules identiques et hétérotypiques au stade modéré de la maladie (Figs. 1, 2 et 3). Des cellules syncytiales de pneumocytes binucléées de type II entièrement fusionnées ont été observées à ce stade de la maladie (Fig. 1). Cependant, à un stade similaire de la maladie, une fusion incomplète de la membrane plasmique (initiation de la fusion membranaire) a été observée dans les cellules d'origine hématopoïétique telles que les monocytes et les neutrophiles (Figs. 2 et 3). Cela indique que les pneumocytes de type II étaient le premier choix du virus pour induire la formation de cellules syncytiales, ce qui peut aider à la réplication et à la protection du virus contre la réponse immunitaire [21]. Cela pourrait être la raison de la fluorescence élevée (indiquant une infection et une multiplication élevées) dans les cellules syncytiales d'origine pneumocyte de type II (Fig. 1). Une étude récente a également soutenu cela, qui a fourni des informations essentielles et les conséquences de la formation de cellules géantes multinucléées après des infections par le SRAS-CoV-2 [16, 20]. En outre, la formation de syncytia homologues a également été signalée dans des cellules Vero in vitro (ACE2 +) exprimant la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 [21].

On suppose que la syncytia peut également contribuer à la dissémination virale et à l'évasion immunitaire en protégeant le virus des cellules immunitaires et des anticorps neutralisants [1, 12]. Dans notre étude, l'initiation de la fusion cellulaire identique (dans les neutrophiles) et hétérotypique (avec les neutrophiles et les monocytes) au stade modéré de la maladie indique l'hyperactivation des protéines fusogènes virales pour initier la formation de syncytia dans ces cellules hématopoïétiques (Figs. 2 et 3). Il a été rapporté que la protéine de pointe virale (S) fonctionnait comme un fusogène à la surface d'une cellule infectée qui interagit avec les récepteurs des cellules voisines pour former des cellules syncytiales [37]. Outre sa capacité à conduire la fusion des membranes virales et cellulaires, la protéine S peut également conduire la fusion des cellules voisines, ce qui entraîne la formation de cellules géantes multinucléées [12, 14, 15]. Cette découverte a également été étayée par une étude récente dans laquelle les syncytia induites par le SRAS-CoV-2 ciblaient les lymphocytes pour l'internalisation et l'élimination à médiation cellulaire, contribuant potentiellement à la lymphopénie et à la pathogenèse chez les patients COVID-19 [20].

La découverte de cellules syncytiales matures et de très grande taille (20–100 μm) d'origine neutrophiles et monocytes à des stades très tardifs et sévères (de type SDRA) des maladies a indiqué le rôle des cellules syncytiales dans la dissémination virale et l'évasion immunitaire. Ces cellules syncytiales géantes peuvent aider à la multiplication et à la protection contre la réponse immunitaire du corps, ce qui peut être la raison de l'activation des macrophages alvéolaires et, finalement, de la tempête de cytokines [20]. Les cellules syncytiales matures n'ont pas été identifiées dans notre imagerie TEM bien qu'elles aient été rapportées dans les échantillons d'autopsie. Cela pourrait être attribué à la libération de moins de ces types de cellules du tissu pulmonaire infecté vers le BALF des patients.

La formation de syncytia est une étape importante pour protéger et aider à la multiplication du virus SARS-CoV-2 après une activation immunologique efficace des patients. L'étude actuelle a montré que la formation de syncytia a d'abord été induite dans les pneumocytes de type II par fusion homotypique et plus tard avec des cellules hématopoïétiques (monocytes et neutrophiles) par fusion hétérotypique au stade modéré (9-16 jours) de la maladie. Les syncytia mûrissent à la phase tardive de la maladie et forment de grandes cellules géantes de 20 à 100 μm. Cette étude ultrastructurale détaillée sur les origines cellulaires uniques et différentes de la syncytia peut explorer la mesure dans laquelle les cellules syncytiales contribuent à la pathologie et donner un aperçu de la biologie de la maladie de COVID-19.

Les numéros d'échantillons biologiques et les détails des patients sont répertoriés dans le fichier supplémentaire 1 : tableau supplémentaire 1.

Leroy H, Han M, Woottum M, Bracq L, Bouchet J, Xie M, Benichou S. Virus-mediated cell-cell Fusion. Int J Mol Sci. 2020;21:9644.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buchrieser J, Schwartz O. Complications de grossesse et protéines transmembranaires induites par l'interféron (IFITM) : équilibrer l'immunité antivirale et le développement placentaire. CR Biol. 2021;344:145–56.

Google Scholar PubMed

Hernandez JM, Podbilewicz B. Les caractéristiques de la fusion cellule-cellule. Développement. 2017;144:4481–95.

Article CAS PubMed Google Scholar

Brukman NG, Uygur B, Podbilewicz B, Chernomordik LV. Comment les cellules fusionnent. J Cell Biol. 2019;218:1436–51.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Segev N, Avinoam O, Podbilewicz B. Fusogens Curr Biol. 2018;28:R378-80.

Article CAS PubMed Google Scholar

Dominguez SR, Travanty EA, Qian Z, Mason RJ. Infection par le coronavirus humain HKU1 des cellules épithéliales alvéolaires humaines primaires de type II : effets cytopathiques et réponse immunitaire innée. PLoS ONE. 2013;8:e70129.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Orenstein JM, Banach B, Baker SC. Morphogenèse du Coronavirus HCoV-NL63 en culture cellulaire : une étude en microscopie électronique à transmission. Open Infect Dis J. 2008;2:52–8.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Franks TJ, Chong PY, Chui P, Galvin JR, Lourens RM, Reid AH, Selbs E, McEvoy CP, Hayden CD, Fukuoka J, et al. Pathologie pulmonaire du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS): une étude de 8 cas d'autopsie de Singapour. Hum Pathol. 2003;34:743–8.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Matsuyama S, Nagata N, Shirato K, Kawase M, Takeda M, Taguchi F. Activation efficace de la protéine de pointe du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère par la protéase transmembranaire TMPRSS2. J Virol. 2010;84:12658–64.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chan JF, Chan KH, Choi GK, To KK, Tse H, Cai JP, Yeung ML, Cheng VC, Chen H, Che XY, et al. Sensibilité différentielle des lignées cellulaires au nouveau bêtacoronavirus humain émergent 2c EMC/2012 : implications pour la pathogenèse de la maladie et ses manifestations cliniques. J Infect Dis. 2013;207:1743–52.

Article CAS PubMed Google Scholar

Qian Z, Dominguez SR, Holmes KV. Rôle de la glycoprotéine de pointe du coronavirus du syndrome respiratoire humain du Moyen-Orient (MERS-CoV) dans l'entrée du virus et la formation de syncytia. PLoS ONE. 2013;8:e76469.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bussani R, Schneider E, Zentilin L, Collesi C, Ali H, Braga L, Volpe MC, Colliva A, Zanconati F, Berlot G, et al. La persistance de l'ARN viral, de la syncytie des pneumocytes et de la thrombose sont des caractéristiques de la pathologie COVID-19 avancée. EBioMédecine. 2020;61:103104.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoffmann M, Kleine-Weber H, Pohlmann S. Un site de clivage multibasique dans la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 est essentiel pour l'infection des cellules pulmonaires humaines. Cellule Mol. 2020;78:779–784e775.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tian S, Hu W, Niu L, Liu H, Xu H, Xiao SY. Pathologie pulmonaire de la pneumonie à nouveau coronavirus de phase précoce 2019 (COVID-19) chez deux patients atteints d'un cancer du poumon. J Thorac Oncol. 2020;15:700–4.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu Z, Shi L, Wang Y, Zhang J, Huang L, Zhang C, Liu S, Zhao P, Liu H, Zhu L, et al. Résultats pathologiques de COVID-19 associés au syndrome de détresse respiratoire aiguë. Lancette Respir Med. 2020;8:420–2.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Braga L, Ali H, Secco I, Chiavacci E, Neves G, Goldhill D, Penn R, Jimenez-Guardeno JM, Ortega-Prieto AM, Bussani R, et al. Les médicaments qui inhibent les protéines TMEM16 bloquent les syncytia induites par les pointes du SRAS-CoV-2. Nature. 2021;594:88–93.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bryce C, Grimes Z, Pujadas E, Ahuja S, Beasley MB, Albrecht R, Hernandez T, Stock A, Zhao Z, AlRasheed MR, et al. Physiopathologie du SRAS-CoV-2 : l'expérience d'autopsie du mont Sinaï COVID-19. Mod Pathol. 2021;34:1456–67.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luo WR, Yu H, Gou JZ, Li XX, Sun Y, Li JX, He JX, Liu L. Résultats histopathologiques dans les poumons explantés d'un patient atteint de COVID-19 traité avec une greffe pulmonaire orthotopique bilatérale. Transplantation. 2020;104:e329–31.

Article CAS PubMed Google Scholar

Rockx B, Kuiken T, Autumn S, Bestebroer T, Lamers MM, Oude Munnink BB, de Meulder D, van Amerongen G, van den Brand J, Okba NMA, et al. un modèle de primate non humain. Science. 2020;368:1012–5.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang Z, Zheng Y, Niu Z, Zhang B, Wang C, Yao X, Peng H, Franca DN, Wang Y, Zhu Y, et al. La protéine de pointe SARS-CoV-2 dicte l'élimination des lymphocytes médiée par le syncytium. La mort cellulaire diffère. 2021;28:2765–77.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buchrieser J, Dufloo J, Hubert M, Monel B, Planas D, Rajah MM, Planchais C, Porrot F, Guivel-Benhassine F, Van der Werf S, et al. Formation de syncytia par les cellules infectées par le SRAS-CoV-2. EMBO J. 2020;39:e106267.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sanders DW, Jumper CC, Ackerman PJ, Bracha D, Donlic A, Kim H, Kenney D, Castello-Serrano I, Suzuki S, Tamura T, et al. Le SRAS-CoV-2 nécessite du cholestérol pour l'entrée virale et la formation pathologique de syncytia. Elife. 2021;10:e65962

Li D, Liu Y, Lu Y, Gao S, Zhang L. La palmitoylation de la protéine S du SRAS-CoV-2 est essentielle pour la formation de syncytia à médiation S et l'entrée du virus. J Med Virol. 2022;94:342–8.

Article CAS PubMed Google Scholar

Cheng YW, Chao TL, Li CL, Wang SH, Kao HC, Tsai YM, Wang HY, Hsieh CL, Lin YY, Chen PJ, et al. La substitution D614G de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 augmente la formation de syncytium et le titre viral via un clivage amélioré de la pointe médiée par la furine. mBio. 2021;12:e0058721.

Article PubMed Google Scholar

Conseils cliniques pour la prise en charge des patients adultes atteints de COVID-19. https://www.icmr.gov.in/pdf/covid/techdoc/COVID_Clinical_Management_19032023.pdf. 05 janvier 2023.

van Kampen JJA, van de Vijver D, Fraaij PLA, Haagmans BL, Lamers MM, Okba N, van den Akker JPC, Endeman H, Gommers D, Cornelissen JJ, et al. Durée et principaux déterminants de l'excrétion de virus infectieux chez les patients hospitalisés avec maladie à coronavirus-2019 (COVID-19). Commune humide. 2021;12:267.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Li X, Ma X. Insuffisance respiratoire aiguë dans le COVID-19 : est-ce un SDRA "typique" ? Soins critiques. 2020;24:198.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, Zhao X, Huang B, Shi W, Lu R, et al. Un nouveau coronavirus de patients atteints de pneumonie en Chine, 2019. N Engl J Med. 2020;382:727–33.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen J, Lu H, Melino G, Boccia S, Piacentini M, Ricciardi W, Wang Y, Shi Y, Zhu T. Infection au COVID-19 : les perspectives de la Chine et de l'Italie. Mort cellulaire Dis. 2020;11:4

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shi Y, Wang Y, Shao C, Huang J, Gan J, Huang X, Bucci E, Piacentini M, Ippolito G, Melino G. Infection au COVID-19 : les perspectives sur les réponses immunitaires. La mort cellulaire diffère. Rév. 2020 ;27:1451–4

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Forni G, Mantovani A. Commission Covid-19 de l'Accademia Nazionale dei Lincei R : Vaccins COVID-19 : où en sommes-nous et défis à venir. La mort cellulaire diffère. 2021;28:626–39.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chaudhary S, Rai P, Joshi A, Yadav P, Sesham K, Kumar S, Mridha AR, Baitha U, Nag TC, Soni KD et al. L'imagerie ultracellulaire du lavage bronchoalvéolaire de jeunes patients COVID-19 présentant des comorbidités a montré une plus grande infection par le SRAS-COV-2 mais des dommages ultrastructuraux moindres que les patients plus âgés. Microsc Microanal 2022 : 1–25.

Chaudhary S, Rai P, Sesham K, Kumar S, Singh P, Nag TC, Chaudhuri P, Trikha A, Yadav SC. L'imagerie microscopique des fluides bronchoalvéolaires de patients intubés positifs au COVID-19 révèle le niveau différent d'infection par le SRAS-CoV-2 sur les cellules épithéliales squamosales orales. Indien J Biochem Biophys. 2021;58:196–207.

CAS Google Scholar

Li Q, Wang Y, Sun Q, Knopf J, Herrmann M, Lin L, Jiang J, Shao C, Li P, He X, et al. Réponse immunitaire dans COVID-19 : quelle est la prochaine étape ? La mort cellulaire diffère. 2022;29:1107–22.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lin L, Li Q, Wang Y, Shi Y. Formation de syncytia lors d'une infection pulmonaire par le SARS-CoV-2 : une unité désastreuse pour éliminer les lymphocytes. La mort cellulaire diffère. 2021;28:2019–21.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng Y, Zhou LL, Su Y, Sun Q. Fusion cellulaire dans la pathogenèse de COVID-19. Mil Med Res. 2021;8:68.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rajah MM, Bernier A, Buchrieser J, Schwartz O. Le mécanisme et les conséquences de la fusion et de la formation de syncytia médiées par les pointes du SRAS-CoV-2. J Mol Biol. 2022;434:167280.

Article CAS PubMed Google Scholar

Télécharger les références

Nous remercions tous les proches des patients de nous avoir permis de collecter le BALF auprès des patients. SAIF-AIIMS New Delhi est reconnu pour l'installation d'imagerie fournie pour le SEM et le TEM. L'installation de microscope confocal DST-FIST est également reconnue pour l'étude de l'immunofluorescence. Le financement par l'ICMR, le SERB et l'AIIMS intra-muros est reconnu.

Ce travail a été soutenu par des subventions du réseau virtuel indo-américain de l'IUSSTF pour le programme COVID-19 (IUSSTF/VN-COVID/007/2020) et du programme DBT-SAHAJ (BT/INF/22/SP44285/2021).

Installation de microscope électronique, Département d'anatomie, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi, Delhi, 110029, Inde

Shikha Chaudhary, Ravi P. Yadav et Subhash Chandra Yadav

Département d'anesthésiologie, de médecine de la douleur et de soins intensifs, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi, Delhi, 110029, Inde

Shailendra Kumar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

SC a réalisé les expériences pour le traitement des échantillons, la normalisation de l'imagerie PAP et IF, la microscopie électronique, l'interprétation des données, la gestion des dossiers cliniques et la génération de figures de microscopie. SK a prélevé l'échantillon dans les services de soins intensifs. SK a participé à la conception de l'étude et à la normalisation des stratégies de collecte d'échantillons. RPY a aidé à la préparation du manuscrit et à l'expérimentation. SCY a conçu l'étude, réalisé et supervisé les expériences des patients COVID-19, analysé les données, généré les chiffres, écrit le manuscrit et dirigé le projet. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale de ce manuscrit.

Correspondance à Subhash Chandra Yadav.

L'approbation éthique du Comité d'éthique institutionnel (IEC), All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) New Delhi, Inde (Réf. No. IEC-307/27.04.2020, RP-10/202) a été obtenue pour l'étude actuelle. Le consentement écrit de tous les représentants des patients a été obtenu pour le prélèvement d'échantillons BALF auprès de patients infectés et intubés par le SRAS-CoV-2.

Tous les auteurs ont approuvé ce manuscrit pour publication. Les intérêts concurrents ne sont pas applicables.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Ci-dessous le lien vers le matériel électronique supplémentaire.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournir un lien vers la licence Creative Commons et indiquer si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La renonciation Creative Commons Public Domain Dedication (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) s'applique aux données mises à disposition dans cet article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit aux données.

Réimpressions et autorisations

Chaudhary, S., Yadav, RP, Kumar, S. et al. Une étude ultrastructurale confirme la formation de cellules syncytiales simples et hétérotypiques dans les fluides bronchoalvéolaires des patients COVID-19. Virol J 20, 97 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02062-7

Télécharger la citation

Reçu : 23 novembre 2022

Accepté : 02 mai 2023

Publié: 19 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s12985-023-02062-7

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt